Genetika

Genetické laboratórium sa zaoberá prenatálnou genetickou diagnostikou, diagnostikou dedičných ochorení a genetickou diagnostikou spojenou s onkologickými ochoreniami.

V oblasti onkologickej genetickej diagnostiky vykonávame genetickú analýzu somatických variantov pri onkologických diagnózach (onkohematológia, kolorektálny karcinóm, skríning rakoviny krčka maternice) a v oblasti neonkologickej diagnostiky sa zaoberáme diagnostikou a prevenciou chorôb, ktoré majú dedičný podklad, kde patrí aj prenatálna genetická diagnostika.

Onkogenetické vyšetrenia sú indikované špecialistami z odborov onkológia za účelom stanovenia diagnózy, monitorovania stavu liečby a včasného zachytenia nástupu relapsu u onkologických pacientov. 

Sme špecializované pracovisko zamerané na širokú paletu onkogenetických a neonkogenetických vyšetrení - najširšiu na súčasnom trhu. Mnohé z nich vykonávame ako jediné pracovisko na Slovensku či v strednej Európe. Testy sú vybrané tak, aby viedli nielen k prenatálnej diagnostike, diagnostike porúch plodnosti, ale zároveň sa stali aj podkladom pre liečbu a monitorovanie onkologických pacientov po liečbe. Našou snahou je poskytnúť klientom komplexnú genetickú diagnostiku mužskej i ženskej neplodnosti, ktorá vedie k jej personalizovanej liečbe podľa genetickej výbavy a potrieb konkrétneho páru. 


NGS sekvenovanie v onkodiagnostike

Sekvenovanie novej generácie NGS v súčasnosti nahrádza klasické postupy molekulárnej biológie na detekciu kauzálnych mutácií v nádoroch. Hlavnými výhodami NGS je testovanie desiatok génov súčasne, za oveľa kratší čas. NGS technológia je významným nástrojom skríningu nádorových ochorení u vysoko rizikových osôb. Potenciál NGS panelového sekvenovania génov v onkodiagnostike je možné použiť na rýchlu diagnostiku, preventívne sledovanie pacientov, personalizovanú terapiu a chirurgické profylaktické zákroky.

Dôvodmi na neonkologické genetické testy sú: vrodené chyby alebo choroba s dedičnosťou v rodine, neplodnosť – odhalenie príčin porúch plodnosti, opakované spontánne potraty, pôrod mŕtveho dieťaťa, plánované tehotenstvo po onkologickej liečbe, príbuzenský vzťah, tehotenstvo (vek matiek nad 35 rokov, pozitívny výsledok ultrazvukového alebo biochemického vyšetrenia, riziko opakovanej dedičnej poruchy v rodine, vystavenie vonkajším vplyvom – lieky, ionizujúce žiarenie a infekčné ochorenie) a iné. Poskytujeme klinicko-genetické vyšetrenie: rozbor osobnej a rodinnej anamnézy oboch partnerov v rámci genetickej konzultácie v našej genetickej ambulancii.

Dnes je už neoddeliteľnou súčasťou prenatálnej genetickej diagnostiky aj skríning geneticky determinovaných ochorení, pričom špecifickou skupinou v rámci prenatálneho skríningu je neinvazívne prenatálne testovanie (NIPT). Spoločnosť Medirex je v oblasti NIPT regionálnym lídrom aktívnym prostredníctvom svojich vlastných testov známych pod názvom TRISOMY test  už od roku 2015. Aktuálne je možné vybrať si v portfóliu TRISOMY testov základné (TRISOMY test a TRISOMY test XY) tak aj pokročilé (TRISOMY test +  a TRISOMY test Complete) typy testov líšiace sa rozsahom vyšetrovaných chromozómových porúch. Najznámejšie poruchy, vyšetrované už v základnom TRISOMY teste, sú trizómie chromozómov 21, 18 a 13 (spôsobujúce Downov, Edwardsov a Patauov syndróm). Na druhej strane najrozsiahlejší typ testu TRISOMY test Complete poskytuje celogenómový sken (v zmysle technickej špecifikácie a s ohľadom na limitácie testu), v ktorom sú vyšetrované desiatky známych chromozómových abnormalít spôsobujúce viac aj menej známe klinické syndrómy. 

V genetickom laboratóriu sú vyšetrenia vykonávané na troch úrovniach – cytogenetika, fluorescenčná in situ hybridizácia a molekulová diagnostika. Máme nastavenú širokú paletu vyšetrení, pomocou ktorých stanovujeme presnú diagnózu pacienta. Pracovisko klinickej genetiky v Bratislave už od roku 2018 začalo realizovať najmodernejšie genetické testovanie pomocou sekvenátorov novej generácie NGS, ktoré umožňujú realizovať panelové vyšetrenia génov, klinického exómu alebo celého exómu.

Poskytujeme komplexnú genetickú diagnostiku pre pacientov


Metodiky používané v rámci genetickej diagnostiky

CYTOGENETIKA –) Pri klinickom podozrení na cytogenetickú aberáciu kultivujeme rôzne druhy biologických materiálov: plodovú vodu, chóriové klky, kostnú dreň, periférnu krv a tkanivá. Výsledkom spracovania kultivovaných materiálov je karyotyp (súbor chromozómov) pacienta, ktorý slúži na vylúčenie akejkoľvek chromozómovej aberácie v rámci diferenciálnej diagnostiky.


FISH – fluorescenčná in situ hybridizácia

Magnetická separácia patologických buniek – pomocou prístroja MACS sme schopní vyseparovať z plnej kostnej drene patologické plazmocyty pri mnohopočetnom myelóme (MM) alebo kmeňových buniek. Princíp spočíva vo využití znakov na povrchu buniek, napr. Syndecan-1, a používa sa CD138+ pozitívna selekcia pri MM. Separáciou získame populáciu buniek jednej línie. Takto získané bunky je možné kultivovať na cytogenetike alebo priamo na nich robiť fluorescenčnú in situ hybridizáciu. Výhodou je získanie suspenzie buniek s vysokým zastúpením patologických buniek, zvyšovanie senzitivity a špecificity použitých metód.


M (multicolor)-FISH – je technika, ktorá je nápomocná v identifikácii drobných, komplexných interchromozómových prestavieb a tzv. marker chromozómov, ktoré nemôžu byť detegované pomocou konvenčnej cytogenetiky. 

m fish 2


mBAND (multicolor BAND) FISH – je technika výhodná pre determináciu zlomov, analýzu intrachromozomálnych prestavieb a môže byť nápomocná pre preparátoch s kratšími chromozómami. 


MOLEKULOVÁ DIAGNOSTIKA

arrayCGH – Metóda array-CGH (komparatívna genómová hybridizácia) je čipová technika. Poskytuje inovatívny postup pri odhaľovaní nebalansovaných zmien (delécií/duplikácií), ktorých umiestnenie v genóme pacientov nie je vopred známe. Metóda je 100x citlivejšia ako karyotyovanie, a preto posúva cytogenetickú diagnostiku na molekulovú úroveň. 

  1. aCGH je vhodný nástroj s vysokou rozlišovacou schopnosťou na detekciu submikroskopických zmien v genóme, 
  2. uplatnenie nachádza v prenatálnej a postnatálnej diagnostike,
  3. prispieva k upresneniu diagnózy, pri prevencii, prognóze, hľadaní vhodnej liečby a prináša diagnostickú informáciu pre prenatálne genetické poradenstvo, 
  4. možnosť uplatnenia je aj v prípadoch, keď zlyhá kultivácia (amniocytov),
  5. umožňuje doriešenie nejasných nálezov iných PCR metodík (NGS, QF-PCR, MLPA).


Multiplex Ligation- dependent Probe Amplification (MLPA) – je metóda založená na kvantitatívnej multiplexovej PCR, ktorá slúži na detekciu relatívneho počtu kópií špecifických sekvencií. Pomocou MLPA metódy je možné identifikovať široké spektrum genomických zmien, predovšetkým rozsiahlejšie delécie/duplikácie v rámci génov alebo chromozómov. V súčasnosti je k dispozícii veľké množstvo MLPA kitov pre diagnostiku rôznych genetických ochorení. Použitie má ako skríningová diagnostika mikrodelečných syndrómov a tiež pri hematologických malignitách si našla obrovské využitie.

Obr. MLPA analýza – detekcia dvojnásobnej trizómie chromozómov X a 18. 


QF-PCR (kvantitatívna fluorescenčná polymerázová reťazová reakcia)

Metóda QF-PCR je vhodná na rýchlu prenatálnu detekciu najčastejších aneuploidií (chromozómy 13, 18 a 21) a na detekciu pohlavia (X, Y) bez predošlej kultivácie buniek plodovej vody (PV). Princípom metódy je namnoženie špecifických sekvencií DNA (STR short tandem repeats – krátke tandemové repetície) pomocou fluorescenčne značených primerov. STR – vysoko polymorfné, krátke tandemovo sa opakujúce markery špecifické pre každý chromozóm. Metóda QF-PCR je založená na porovnaní intenzít fluorescenčných signálov získaných namnožením STR DNA dvojice konkrétnych chromozómov. Stanovuje sa pomer a počet, v akom sa jednotlivé párové a pohlavné chromozómy vo fetálnom genóme vyskytujú. Fluorescenčný signál (pík) zobrazuje jednotlivé alely jedinca. Porovnaním výšky (zhodnotením pomeru plochy píkov) získame informácie o počte chromozómov. Výhodou QF-PCR je schopnosť detegovať maternálnu kontamináciu vo vzorke PV a tiež preukázať paternitu, uniparentálnu dizómiu a dokonca určiť zygozitu dvojčiat.

Obr. Elektroforetogram multiplex QF-PCR špecifických chromozómov 


Monitorovanie hladiny fúzneho génu BCR-ABL: cieľom je zabezpečiť kvalitnú diagnostiku monitorovania hlbokej molekulovej odpovede pacientov s CML (chronická myelocytová leukémia. Len 2 laboratóriá (Medirex a.s. a NOU) na Slovensku získali konverzný faktor (CF), ktorý slúži na uvádzanie výsledkov v medzinárodnej škále. Získali sme certifikát. 

Robíme komplexnú diagnostiku CML) pacientov: 

  1. Diagnostické vyšetrenie génu BCR-ABL metódou multiplex PCR (určenie 8 typov zlomov BCR-ABL-(b2a2, b3a2, e1a2, c3a2, b1a1, b3a3, b2a3, a1a3).
  2. Molekulové monitorovanie transkriptu BCR-ABL (akreditovaná).
  3. Detekcia mutácií v kinázovej doméne BCR-ABL.


Farmakogenomické testy: farmakogenomické testy sa využívajú na testovanie individuálnej citlivosti na špecifickú liečbu. Niektorí jedinci môžu k účinnosti liečby potrebovať vyššie dávky, zatiaľ čo iní môžu vykazovať nežiaduce reakcie už na normálne dávky liekov. Medirex ponúka od 1. 12. 2013 viacero farmakogenomických testov (5FU, CYP2D6, TPMT, IL-6).